3月5日，南京農(nóng)業(yè)大學陶小榮教授團隊聯(lián)合中國科學院生物物理研究所王祥喜研究員團隊，在全球植物學頂級期刊《Nature Plants》在線發(fā)表突破性研究成果，首次解析番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）RNA復制酶全長三維結(jié)構(gòu)，為靶向抗病毒新農(nóng)藥研發(fā)開辟全新路徑。這項歷時六年的研究攻克了植物病毒學領域復制酶結(jié)構(gòu)解析的重點難題，揭示了復制酶激活及其雙靶點抑制的分子機制，使人們得以窺見植物病毒遺傳物質(zhì)復制機器的“廬山真面目”。

植物病毒作為一類新的病原體被發(fā)現(xiàn)已有一個多世紀，當前已成為危害全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要病原物，每年造成的經(jīng)濟損失超過600億美元，目前還沒有有效的抗植物病毒藥劑。植物病毒百分之八十以上是RNA病毒，它們都編碼一個高度保守的RNA復制酶催化合成病毒的基因組RNA，是病毒生命周期中遺傳物質(zhì)復制的關(guān)鍵蛋白酶。因此，病毒RNA復制酶是領域內(nèi)公認的非常理想的抗病毒藥劑靶標。盡管國際病毒分類委員會正式認定的植物病毒種類迄今已超過2100種，但尚無一例植物病毒完整復制酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息。原子水平上對植物病毒復制激活與調(diào)控機制等具體過程認識的不足，嚴重制約了植物病毒靶向藥物的設計與研發(fā)。

番茄斑萎病毒RNA復制酶激活及其雙靶點抑制機制模式圖

“巧婦難為無米之炊，我們終于逮到這個大家伙去下鍋了”，論文共同第一作者李佳副教授回憶起當時獲得TSWV RNA復制酶全長蛋白時仍非常興奮。在超過2100種的植物病毒中，TSWV是最具經(jīng)濟重要性和科學重要性的十大植物病毒之一，能侵染85科1000多種植物，其編碼的RNA復制酶（也稱作L蛋白）分子量巨大，全長蛋白高達330 kDa，是目前已知所有植物病毒中最大的RNA復制酶之一，表達極為困難。研究人員通過對核酸序列進行密碼子優(yōu)化、促溶標簽摸索以及篩選不同表達系統(tǒng)等，最終利用昆蟲Hi-five細胞成功純化獲得了毫克級別的高純度蛋白樣品，克服了330 kDa全長蛋白的表達瓶頸。借助冷凍電鏡技術(shù)，團隊成功捕獲了復制酶未結(jié)合底物的失活態(tài)、結(jié)合病毒RNA后的激活態(tài)以及結(jié)合抗病毒藥物后的抑制態(tài)結(jié)構(gòu)特征，繪制出首張完整植物病毒復制酶三維圖譜。

結(jié)構(gòu)信息顯示TSWV RNA復制酶結(jié)構(gòu)域組成相對目前已知的人和動物病毒復制酶更為復雜，總體可參考流感病毒聚合酶劃分為三個主要區(qū)域：N端的核酸內(nèi)切酶區(qū)域、中央核心區(qū)的RNA聚合酶區(qū)域以及C端包含抓帽結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)。核心區(qū)域的結(jié)構(gòu)保守性揭示了植物病毒與動物病毒的共同進化起源；N端和C端結(jié)構(gòu)域顯著大于其它已解析的同類病毒復制酶結(jié)構(gòu)域，并具有獨特的結(jié)構(gòu)特征。通過深度挖掘分析以及功能驗證，發(fā)現(xiàn)了一個在所有布尼亞病毒的復制酶催化中心高度保守的新基序I，這是自2015年基于人類病毒（拉克羅斯病毒）研究發(fā)現(xiàn)新基序G和H以來，基于植物病毒研究再度發(fā)現(xiàn)新的酶活中心關(guān)鍵保守基序，為病毒學領域全面認識病毒RNA復制酶的結(jié)構(gòu)特征提供了新的認識。

研究發(fā)現(xiàn)TSWV RNA復制酶催化中心保守基序F的柔性環(huán)在未結(jié)合病毒基因組RNA時處于高度無序狀態(tài)，當加入病毒基因組RNA保守序列后，保守基序F可發(fā)揮“傳感器”作用感知病毒基因組RNA末端的保守順式作用元件，并穩(wěn)定柔性環(huán)；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后的保守基序F與保守基序I等發(fā)生相互作用，進一步作為“適配器”促進完整催化中心的形成，使復制酶處于激活狀態(tài)?！拔覀兤平饬瞬《咀晕壹せ畹姆肿娱_關(guān)?！惫餐谝蛔髡卟芾诟毖芯繂T指出，病毒基因組5’末端10個堿基長度的RNA序列形成的“鉤”狀結(jié)構(gòu)是觸發(fā)復制酶激活的關(guān)鍵。研究還發(fā)現(xiàn)核苷類藥物利巴韋林及其代謝物利巴韋林三磷酸鹽能通過雙靶點抑制機制阻斷這一過程，完全抑制TSWV在植物中的復制侵染；結(jié)構(gòu)與生化數(shù)據(jù)表明利巴韋林及其三磷酸鹽均能特異性靶向TSWV RNA復制酶上RNA“鉤”狀結(jié)構(gòu)結(jié)合空腔的進入通道和酶活催化中心。

“長期以來，種植抗病品種和使用殺蟲劑控制傳毒媒介昆蟲是生產(chǎn)上預防病毒侵染和減少病害損失的主要手段。然而，對于已經(jīng)感染病毒的植物，基本無藥可用。番茄斑萎病毒RNA復制酶結(jié)構(gòu)的解析填補了植物病毒復制酶結(jié)構(gòu)生物學的空白。研究揭示的獨特雙靶點抑制機制不僅對植物病毒農(nóng)藥也對人和動物中的分節(jié)段負鏈RNA病毒抑制劑研發(fā)提供了非常重要的靶點?！闭撐耐ㄓ嵶髡咧惶招s教授介紹。目前，研究成果已申請專利，研究團隊正基于結(jié)構(gòu)信息以及關(guān)鍵靶點建立小分子化合物篩選平臺，與國內(nèi)多家單位開展合作研發(fā)。

南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)林生物安全全國重點實驗室李佳副教授和中國科學院生物物理研究所曹磊副研究員為該論文的共同第一作者，中國科學院生物物理研究所王祥喜研究員和南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)林生物安全全國重點實驗室陶小榮教授為共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學博士研究生趙雅倩、碩士研究生沈靜涵以及中科院生物物理所博士研究生王磊參與了本研究。荷蘭瓦赫寧根大學Richard Kormelink教授、南京農(nóng)業(yè)大學葉永浩教授、朱敏副教授、馮明峰博士為本研究提供了重要幫助。研究工作得到了國家杰出青年基金、國家自然科學基金重點項目、以及江蘇省自主創(chuàng)新基金等項目經(jīng)費的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-025-01940-y