近日，南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省家畜胚胎工程研究中心/動物科技學院肉羊創(chuàng)新團隊萬永杰教授和張艷麗教授課題組在Protein & Cell期刊在線發(fā)表了題為“An upgraded nuclease prime editor platform enables high-efficiency singled or multiplexed knock-in/knockout of genes in mouse and sheep zygotes”的研究成果。該研究在基因編輯技術研究領域取得重要進展，成功利用升級后的核酸酶先導編輯器（uPEn）在湖羊中實現(xiàn)MSTN/PPARG雙基因高效編輯，為畜禽基因編輯育種提供了新的技術手段。

CRISPR-Cas基因組編輯技術的問世，為精準遺傳操作打開了大門。在這一領域不斷的探索中，2019年開發(fā)的“先導編輯”（Prime Editing，PE）技術實現(xiàn)了重要突破，其通過結合帶有逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）結構域的Cas9缺口酶融合蛋白和先導編輯向?qū)?/span>RNA（pegRNA），在DNA上實現(xiàn)小型精準編輯。盡管PE技術展現(xiàn)出廣泛的應用前景，尤其在畜牧育種領域，可用于引入有利基因型促進種質(zhì)創(chuàng)新，但其在動物受精卵中的編輯效率較低，限制了實際應用。

為了應對這一挑戰(zhàn)，南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院萬永杰教授和張艷麗教授團隊與南京大學劉江懷教授團隊合作，嘗試運用一種基于核酸酶PE變體（PEn）的新型工具uPEn。該工具集成了一個輔助DNA修復途徑的調(diào)節(jié)模塊（i53），在細胞實驗中展現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)PE和PEn工具的編輯效率。

研究人員首先在細胞中對比了全長和拆分版本的uPEn，結果顯示兩種形式均能實現(xiàn)基因小片段的精準敲入。隨后，團隊將RNA形式的uPEn注射至小鼠受精卵中，成功在脂肪代謝相關基因Pparg（γ2）的上游插入優(yōu)化Kozak序列，獲得了可穩(wěn)定遺傳的編輯小鼠（founder）。純合小鼠的F2代細胞中，PPARγ2蛋白表達顯著上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)證實了uPEn在基因表達調(diào)控中的應用價值。

接下來，研究人員在湖羊受精卵中用全長或拆分uPEn，分別針對PPARG基因進行Kozak基序敲入，同時靶向敲除MSTN基因。基因型分析結果顯示，uPEn在PPARG處有效地敲入了Kozak基序（8/15羔羊，每只編輯羔羊的正確編輯率的中位數(shù)為50.11%），并且6只羔羊同時達成了雙基因編輯（6/15），進一步證實了uPEn工具在多位點基因編輯中的強大靈活性。

此次研究成功獲得了雙基因敲入/敲除的湖羊，為進一步探索基因編輯對產(chǎn)肉量和肉質(zhì)性狀的影響奠定了基礎。這些研究成果表明，uPEn在畜牧業(yè)種質(zhì)創(chuàng)新中的巨大潛力，為精準育種提供了全新工具。后期研究有待進一步降低uPEn核酸酶活性所導致的部分非準確編輯以及優(yōu)化其編輯保真性。未來，基因編輯技術的持續(xù)發(fā)展將進一步推動精準育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為全球糧食安全和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有力支持。

南京農(nóng)業(yè)大學為第一署名單位和通訊單位，南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院碩士研究生冒魏佳和南京大學醫(yī)學院模式所博士研究生王佩為該研究的共同第一作者，萬永杰教授（南京農(nóng)業(yè)大學）、劉江懷教授（南京大學）、張艷麗教授（南京農(nóng)業(yè)大學）為共同通訊作者。該研究得到了南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院王鋒教授、浙江大學醫(yī)學院黃興許教授、之江實驗室研究專家婁鑫、碩士生周磊、博士生李東旭、博士生李向陽的參與支持。此外，研究還得到了國家重點研發(fā)計劃（2021YFF1000700和2019YFA0802802）和國家自然科學基金（32172735）的資助。該技術已申請國家發(fā)明專利（申請?zhí)枺?/span>202410315649.6）。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/procel/pwaf006