白菜類蔬菜原產(chǎn)中國(guó)，是一種世界性的蔬菜作物，其富含礦物質(zhì)、膳食纖維、維生素，對(duì)調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、新陳代謝及預(yù)防疾病具有重要作用，深受人們喜愛。白菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率低下，已成為嚴(yán)重制約其基因挖掘和功能研究的一大障礙。近些年來(lái)，生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控因子極大地提高了其他物種的遺傳轉(zhuǎn)化效率。同時(shí)，發(fā)根農(nóng)桿菌高效的侵染效率為改良白菜的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的思路。
近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在Plant Physiology雜志發(fā)表了題為“Efficient genetic transformation and gene editing of Chinese cabbage mediated by Agrobacterium rhizogenes”的研究論文。該研究利用了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)共表達(dá)ZmWUS2-IPT-AtPLT5三個(gè)基因，結(jié)合可視化標(biāo)記RUBY的篩選和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功地在白菜中建立了一種無(wú)基因型限制的、簡(jiǎn)單高效的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯系統(tǒng)，無(wú)需使用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化或激素進(jìn)行芽再生。從種子萌發(fā)到愈傷組織誘導(dǎo)、芽再生和生根的整個(gè)過(guò)程可以在3個(gè)月內(nèi)完成。這種轉(zhuǎn)化方法可以克服白菜品種遺傳轉(zhuǎn)化的基因型依賴性，為白菜及蕓薹屬蔬菜作物的功能基因組學(xué)研究、基因編輯和種質(zhì)創(chuàng)新提供了底盤技術(shù)。
該研究首先以不結(jié)球白菜品種‘四九菜心’為實(shí)驗(yàn)材料，含有ZmWUS2-IPT-AtPLT5和RUBY過(guò)表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌（K599）侵染發(fā)芽5-6天的帶子葉下胚軸，15-25天后在侵染部位長(zhǎng)出根和愈傷，把帶芽的紅色愈傷繼代培養(yǎng)，獲得了紅色陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，帶有紅色皺葉和多分枝表型，并且可以正常授粉和結(jié)籽，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)20.48%。研究人員進(jìn)一步在更多的白菜材料，包括用傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)化的材料中測(cè)試該系統(tǒng)。令人欣喜的是，所有供試材料都在ZmWUS2-IPT-AtPLT5的作用下實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率在3.31%-15.55%。這些供試材料中包括白菜參考基因組材料NHCC001（蘇州青，不結(jié)球白菜）和Chiifu（大白菜）以及多個(gè)用于育種的優(yōu)良自交系。
研究者也將ZmWUS2-IPT-AtPLT5和CRIPSR/Cas9基因編輯系統(tǒng)整合到一起，并成功在白菜中實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯。通過(guò)對(duì)Phytoene Desaturase（PDS）基因的敲除，成功獲得了白化植株，利用PCR和Sanger測(cè)序來(lái)確認(rèn)白化再生植株的基因編輯，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變由替換、短插入或缺失組成，證實(shí)了新開發(fā)的白菜遺傳轉(zhuǎn)化方法用于基因編輯的可行性。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院碩士生王耀龍為該論文的第一作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室張昌偉副教授、侯喜林教授和北卡羅萊納州立大學(xué)劉武生教授為該論文的共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院李英教授、劉同坤教授、吳寒副教授、王燕副教授、肖棟博士和王文龍、陳曉山、高瞻遠(yuǎn)、徐歡歡等研究生，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所楊學(xué)東副研究員和南京蘇曼等離子工程研究院有限公司的科研人員也參與了該項(xiàng)工作。該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題（2022YFD1200502）、江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項(xiàng)目（JBGS[2021]064）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目和the Hatch project 02685 from the U.S. Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture的資助。該技術(shù)已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枺?024105625686。
文章鏈接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiae543